Discussion
La méthode de cytométrie d'image proposée dans ce travail démontre la capacité d'analyser rapidement et efficacement l'autophagie dans les cellules vivantes pour le dépistage de médicaments potentiels pouvant induire ou inhiber des activités autophagiques, telles que la promotion de la clairance des protéines mal repliées associées à la neurodégénérescence ou l'inhibition de la résistance aux médicaments associée au cancer. La limitation des méthodes actuelles peut être surmontée par la cytométrie d'image et des réactifs uniques pour développer une nouvelle méthode de détection de l'autophagie. La vision par cellomètre a déjà été utilisée pour des dosages à base de cellules fluorescentes (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et coll., 2011), et il a été démontré que le colorant autophagique Cyto-ID colorait spécifiquement les autophagosomes dans les cellules vivantes. Dans ce travail, le colorant Cyto-ID se colocalise avec la RFP-LC3 dans des cellules HeLa affamées, ce qui valide davantage la spécificité du colorant.
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La quantité de lumière mesurée correspond à la taille des cellules et à leur complexité. Les, par exemple, reflètent davantage de lumière que les lymphocytes B ou T à surface lisse en raison de la texture rugueuse de leur surface et de la quantité plus élevée de vésicules présentes dans la cellule. L'analyse de la diffraction de la lumière selon un angle plat est appelée prodiffusion (FSC, forward scatter), laquelle dépend du volume de la cellule. L'analyse de la diffraction de la lumière dans un angle droit est appelée diffusion latérale (SSC, sidewards scatter). Elle dépend de la granularité, de la taille des cellules, de la structure de leur noyau, et de la quantité de vésicules contenues dans les cellules. Par exemple, il est possible de distinguer des globules rien qu'en observant ces deux analyses (Fig. 1). Fig. 1. Caractérisation de cellules non colorées à l'aide d'une diffusion de lumière (graphique à points) En haut à droite: grosses cellules En haut: cellules granulaires Les grosses cellulaires granulaires (par ex., les) sont visibles en haut à droite tandis que les petits globules blancs, qui sont lisses, sont visibles en bas à gauche.
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Le logiciel de cellomètre peut analyser la fluorescence des cellules en additionnant le total des pixels fluorescents dans chaque cellule, ou en mesurant uniquement les pixels à haute intensité fluorescente des autophagosomes dans chaque cellule. Une autre différence pourrait être causée par le stress de cisaillement de la cytométrie en flux affectant la viabilité des cellules cibles (Robey et al., 2011). Le flux autophagique est également un test important pour développer une nouvelle méthode de détection. Le CQ est utilisé pour inhiber la dégradation lysosomale des autophagosomes, où l'activité autophagique serait la plus élevée pour les cellules Jurkat affamées de nutriments en présence de CQ en raison de l'interaction synergique entre les traitements. Le prochain plus élevé serait les cellules Jurkat en famine sans CQ. Seule une légère augmentation de l'activité autophagique serait observée par les cellules Jurkat avec CQ uniquement par rapport au contrôle en raison de l'accumulation d'autophagolysosomes basaux.
En bref, le cytomètre en image NC-3000™ est une nouvelle technologie qui permet d'analyser de manière précise et fiable les moindres altérations de l'homéostasie cellulaire au sein de grandes populations. Contrairement à la cytométrie en flux conventionnelle, le NC-3000™ permet à l'utilisateur de valider l'échantillon par inspection visuelle des cellules individuelles. Olaf Nielsen, Anna Fossum et Soren Kjaerulff.
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